Marjo K. Hytoёnen, Anaiёs Grall, Benoit Heґdan, Steґphane Dreґano, Samuel J. Seguin, Delphine Delattre, Anne Thomas, Francis Galibert, Lars Paulin, Hannes Lohi, Kirsi Sainioy, and Catherine Andreґy

Ancestral T-Box Mutation Is Present in Many, but Not All, Short-Tailed Dog Breeds

The American Genetic Association. 2008

Наследственная мутация T-Box (натуральный бобтейл) присутствует у многих, но не у всех короткохвостых собаках.

Породы собак поражают своим морфологическим разнообразием и уникальными характеристиками. К таким характеристикам в частности относится и длина хвоста – его фенотип. Врожденно короткие хвосты (куцые) встречаются во многих породах, но генетические исследования по локализации Т-гена (C189G), отвечающего за натуральный куцый хвост, до настоящего времени проводились только на куцехвостых собаках породы Вельш Корги Пемброк.

В этой статье, мы публикуем результаты исследования на наличие мутации T-гена в 23 других породах, в которых встречаются натуральные бобтейлы. Локус-группа включала 360 собак, из которых 156 имели врождённо куцый хвост. Результаты исследования показали, что в 17 породах, в которых выявлена мутация Т-гена (C189G), она напрямую связана с проявлением фенотипа куцего хвоста. Однако также было выявлено 6 пород, не несущих изменённого гена или же другой мутации в локусе Т-box.

Вторая часть исследования была посвящена эффектам мутации Т-гена в гомозиготном состоянии. Мы доказали, что собаки с гомозиготным Т-геном (C189G) в природе не встречаются, что подтверждает летальность Т-гена (C189G) в гомозиготном состоянии. Дополнительно в целях изучения летального эффекта мутации Т-гена (C189G) в гомозиготе, мы сравнили количество щенков в помётах, рожденных от куцехвостых родителей, с количеством щенков в помётах родителей с длинными хвостами. На примере породы Шведский Вальхунд мы наблюдали снижение численности приплода на 29% в случаях, когда оба родителя были куцехвостыми.

Целью исследования также стала локализация других генетических факторов, влияющих на появление натуральных куцых хвостов при условии, что мутация Т-гена (C189G) есть не во всех породах с врождённо коротким хвостом. Соответственно, ставилась цель обнаружить и другие генетические факторы, влияющие на фенотип хвоста.

Домашние собаки стали главными объектами генетических исследований по ряду причин, во-первых, в силу обширного количества вариаций фенотипов, во-вторых, собаки разных пород обладают уникальными признаками и, порой, радикально отличаются друг от друга, и, в-третьих, что немаловажно, благодаря полной расшифровке генетического кода собаки (генома) в 2003 году[1].

Итак, отбор в разведении наделил многие породы специфическими морфологическими характеристиками, к которым относится и длина хвоста. Длина хвоста зависит от количества позвонков, которое может существенно различаться у каждой конкретной особи. В некоторых породах собак закреплены очень короткие хвосты (брахиурия[2]), а также, как показано на рисунке 1, практически полное его отсутствие.

Рисунок 1. Бурбонский пойнтер. Три варианта фенотипов хвостов:
отсутствие хвоста слева, короткий хвост (брахиурия) в центре и длинный хвост справа (фото: Michael Comte).

Генетическое наследование фенотипа короткого хвоста выявлено в породе Вельш Корги в 2000 году[3]. В результате исследования было установлено, что причиной появления короткого хвоста служит мутация Т-гена (C189G) в экзоне 1, влияющая на ДНК-связывающую способность Т-протеина. То есть особи, имеющие мутацию Т-гена, обладают врождённо куцыми хвостами и при этом длина хвоста может существенно разниться – от практически полного его отсутствия до укороченного до половины. При исследовании генотипа собак породы Вельш Корги Пемброк, помимо гетерозиготной мутации Т-гена (C189G), влияющей на врождённо куцый хвост, также было выявлена прямая зависимость мутации в гомозиготном состоянии с летальностью эмбрионов[4]. Выявленные мутации Т-гена у исследуемых мышей были причиной ранней эмбриональной смертности или приводили к аномалиям развития мезодермальных[5] тканей, в том числе хвоста и позвоночника. Тем самым было доказано, какую существенную роль играет Т-ген в эмбриональном развитии млекопитающих[6], а его полиморфное наследование с другими  мутантными генами, такими как: Pax1 и Wnt-3a влияет на эмбриональное развитие[7].

В породе Вельш Корги Пемброк длина натурального куцего хвоста варьируется от почти полного его отсутствия до коротких хвостов в половину длины стандартного хвоста, также встречаются хвосты с заломами. В качестве сравнения приведём пример другого – рецессивного – наследования куцего хвоста в породе бульдог, когда все собаки с куцыми хвостами имеют ещё и множественные заломы[8]. Вместе с этим в некоторых породах есть упоминания о куцехвостых собаках, родившихся от длиннохвостых родителей, что опять же говорит о нескольких вариантах наследования или же неполной пенетрантности —проявления в фенотипе.

Мы изучили наличие мутации Т-гена на большом числе пород, чтобы исследовать его возможную наследственную природу, и с целью определить существуют ли другие генетические факторы проявления фенотипа куцых хвостов. В тестировании участвовали представители 23-х разных пород и результаты показали наличие мутации Т-гена (C189G) у каждой куцехвостой собаки в 17-ти породах, что подтверждает прямую связь мутации с фенотипом хвоста. Вместе с тем на практике было доказано, что мутация Т-гена напрямую влияет на количество щенков в помёте от 2-х куцехвостых родителей на примере породы Шведский Вальхунд, что подтверждает особую важность Т-гена в эмбриогенезе.

Материалы и методы

Животные и определение фенотипа хвоста

Образцы для исследований были отобраны у 360 собак (156 куцехвостых и 204 длиннохвостых собак; см. таблицу 1) 23 пород. Кроме того, был собран генетический материал ещё у 80 собак 9-ти пород, фенотип которых включает исключительно длинный хвост (американский кокер-спаниель, бишон фризе, английский сеттер, английский спрингер-спаниель, золотистый ретривер, длинношерстная такса, ши-тсу, гладкая такса и йорк).

Таблица 1. Результаты генотипов мутации Т-гена (C189G) в 23 породах, несущих фенотип короткого хвоста

Общее количество собак

Количество длиннохвостых собак

Генотип по С189

Количество куцехвостых собак

Генотип по С189

17 пород с мутацией С189G

Автралийская овчарка

70

42

С/С

28

С/G

Автралийский пинчер

2

1

С/С

1

С/G

Австралийская пастушья собака

2

0

С/С

2

С/G

Бурбонский пойнтер

25

16

С/С

9

С/G

Бразильский терьер

17

7

С/С

10

С/G

Бретонский спаниель

18

4

С/С

14

С/G

Хорватская овчарка

3

1

С/С

2

С/G

Датско-шведская фермерская собака

2

1

С/С

1

С/G

Джек-рассел терьер

10

7

С/С

3

С/G

Карельская медвежья собака

6

3

С/С

3

С/G

Муди

10

5

С/С

5

С/G

Польская низинная овчарка

28

10

С/С

18

С/G

Пиренейская овчарка

64

57

С/С

7

С/G

Альпийская овчарка

17

15

С/С

2

С/G

Шипперке

12

4

С/С

8

С/G

Испанская водяная собака

7

3

С/С

4

С/G

Шведский вальхунд

22

6

С/С

16

С/G

6 пород без мутаций С189G

Бостонский терьер

4

0

С/С

4

С/G

Английский бульдог

5

0

С/С

5

С/G

Кинг-Чарльз спаниель

22

13

С/С

9

С/G

Миниатюрный шнауцер

6

4

С/С

2

С/G

Парсон-рассел-терьер

3

2

С/С

1

С/G

Ротвейлер

5

3

С/С

2

С/G

У всех исследуемых собак были собраны данные родословных и вся дополнительная информация по фенотипу хвоста (анурия (отсутствие хвоста), брахиурия или длинный хвост). Информация по фенотипам хвостов по длине разделялась на полное отсутствие позвонков хвостового отдела позвоночника (анурия) и короткий хвост разной длины (брахиурия). Сведения по фенотипу хвостов были взяты из базы данных разведения Финского Кеннел Клуба за 2008 год или были непосредственно сообщены нам владельцами собак.

Образцы ДНК

Образцы исследовались двумя отдельными методами: анализ на наличие этилендиаминтетрауксусной кислоты в крови и генетический анализ клеток эпителия с защечной области ротовой полости, который проводился с помощью исследовательских комплектов NucleoSpin Kit (Macherey-Nagel, Hoerdt, France) или BuccalAmp DNA Extraction Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI). Также некоторые образцы низкого качества повторно проверялись с помощью V2 Genomiphi Kit (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK).

Полимеразная цепная реакция и секвенирование

Все образцы с мутацией Т-гена (C189G) в экзоне 1 тестировались с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) ДНК по методу Хауорта, описанного им в 2001 году, либо с помощью изучения следующих основных пар: 5'-AGAGCCTGCAGTACCGAGTG-3', локализованной в экзоне 1 Т-гена и 5'-CCGAGACTTCTCCCAGAAAA-3' – в интроне 1. Наличие мутации в амплифицированном образце ПЦР обнаруживалось с помощью:

1) анализа рестрицирующих ферментов;

2) секвенции.

1) Анализ рестрицирующих ферментов проводился с использованием BstEII фермента (New England Biolabs, Ipswich, MA) с последующей визуализацией на агарозном геле. У куцехвостых собак, не имеющих в своем генотипе мутации Т-гена, все кодирующие экзоны и окружающие локус участки секвенировали путём сплайсинга[9] по методу основных пар, описанному в 2001 году Хауортом в соавторстве. Исключением стало исследование экзона 8, в котором использовалась следующая пара: 5'-GCGGAGAAGGTGCCTTAGTA-3' и 5'-CCTGGGAGGTCAATCAAATC-3'.

2) Образцы ПЦР очищались при помощи ExoSAP-IT (GE Healthcare) и секвенированы с помощью BigDye Terminator v3.0 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) и анализатора ДНК ABI PRISM 3130XL DNA analyzer (Applied Biosystems). Результаты секвенирования анализировались с помощью компьютерного анализа ДНК V5.2 (Applied Biosystems). Количество нуклеотидов в исследовании вычислялось по данным кодона Т-гена (GenBank AJ245513).

Статистический анализ

Предположительный эффект гомозиготной мутации Т-гена на эмбриональную жизнеспособность оценивался на пометах от куцых родителей и сравнивался с помётами, полученными от родителей с длинными хвостами породы Шведский Вальхунд. Статистические показатели исследованной группы измерялись с помощью программы Student’s t-test.

Результаты

Мы проанализировали наличие в генотипе мутации Т-гена, C189G (Ile63Met) в 23 породах. Для исследований было отобрано 360 собак, из которых 156 были врожденно куцыми и 204 с длинными хвостами. Мы определили 17 пород, в которых куцехвостые собаки несли мутирующий Т-ген, и 6 пород, в которых он отсутствовал (см. таблицу 1). Более того, мутация Т-гена не обнаружена в выборке из 80 собак, принадлежащих к 9 породам, не обладающим фенотипически куцым хвостом (американский кокер спаниель, бишон фризе, английский сеттер, английский спрингер спаниель, золотой ретривер, длинношерстная такса, ши-тсу, гладкошерстная такса и йорк). Дополнительно мы увеличили список пород, проанализированных Хавортом и соавторами в 2001 году, с 19 до 28. И тем самым подтвердили, что данная мутация не имеет полиморфного наследования. В 6 породах, в которых мутация Т-гена отсутствовала, мы искали любые другие изменения в локусе T-гена, что могло бы объяснить наличие фенотипически короткого хвоста. Для этого мы секвенировали все кодирующие экзоны, пограничные экзоны и интроны, а также все нетранслируемые участки ДНК (UTR). Следует отметить, что секвенирование не выявило каких-либо причин для данной мутации в каждой из 6 пород. И в добавление к нескольким полиморфным локусам, описанным Хауортом, в нашем исследовании был обнаружен измененный нуклеотид в локусе 5' UTR (G-6A) ДНК в породе цвергшнауцер. Таким образом, нами выявлено, что в породе цвергшнауцер присутствует полиморфное наследование короткого хвоста от родителей с длинными хвостами, но при этом сам локус Т-гена не является причиной проявления куцехвостости потомков и в данном случае исключен из процесса наследования.

Эти результаты доказывают, что мутация Т-гена присутствует во многих, но не всех породах с коротким хвостом, и что на длину хвоста влияют и другие генетические факторы.

В выборке из 315 собак, принадлежащих к 17 породам, у 133 куцехвостых собак нами была обнаружена мутация Т-гена (C189G) в гетерозиготном состоянии и остальные 182 собаки с длинными хвостами не несли этой мутации. Данный результат косвенно указывает на полную пенетрантность и летальность гомозиготных мутаций.

Для дальнейшего подтверждения летальности Т-гена в гомозиготном состоянии, мы просчитали размеры пометов в двух вариантах - пара производителей с длинными хвостами и пара производителей с куцыми хвостами (длинный хвост х длинный хвост и куцый хвост х куцый хвост) на примере собак породы Шведский Вальхунд. Для вычислений использовалась База данных по разведению Финского Кеннел Клуба по данным на 2008 год (the KoiraNet Breeding Database from the Finnish Kennel Club (2008), см. Рисунок 2).

Рисунок. 2. Сравнение размеров пометов по двум вариантам скрещивания в породе Шведский Вальхунд.
Среднестатистический показатель количества щенков в помете от пары родителей с длинными хвостами составляет 5,5 щенков.
Среднестатистический показатель количества щенков в помете от пары родителей с куцыми хвостами составил 3,9 щенков.
Таким образом размер помета, когда оба родителя являются куцехвостыми, на 29% ниже по количеству, чем от родителей с длинными хвостами (*** Р < 0,001).
езультаты даны в виде среднего значения (значение столбца) ± с допустимой погрешностью (погрешность учтена при расчете таблицы).

Обсуждение

Почему вопрос наследования натуральных куцых хвостов стал таким важным именно сейчас? Ответ – в запрете на купирование хвостов в большинстве европейских стран. Купированные собаки не имеют права участвовать в официальных выставках в отличие от натуральных бобтейлов. И, чтобы получить доступ к участию в шоу, владельцу куцей собаки необходим ветеринарный сертификат, подтверждающий естественное происхождение куцего хвоста. Благодаря нашему исследованию определение натуральности короткого хвоста может быть заменено простым генетическим тестом, который подтверждает его естественное происхождение, а также наше исследование существенно расширило список пород, которые могут пройти генетическое тестирование на наличие гена куцего хвоста.

Выражение признательности

Мы благодарим всех участвующих в дискуссии заводчиков, ветеринаров и владельцев собак, предоставивших образцы для исследования, особую благодарность выражаем Pa¨ivi Eerola, Michae¨l and Michel Comte; Pierre Willems, Christian Dagorne, Anka Obrist, Norbert Gainche, сообществу‘‘Amis des Epagneuls Nains Anglais’’; профессору B. Denis и профессору B. Cattanach. BSc, PhD DSc, FRS.

Marjo K. Hytoёnen, Anaiёs Grall, Benoit Heґdan, Steґphane Dreґano, Samuel J. Seguin,
Delphine Delattre, Anne Thomas, Francis Galibert, Lars Paulin, Hannes Lohi,
Kirsi Sainioy, and Catherine Andreґy

Ancestral T-Box Mutation Is Present in Many, but Not All, Short-Tailed Dog Breeds

The American Genetic Association. 2008

http://jhered.oxfordjournals.org/content/100/2/236.full.pdf

Перевод Алевтина Кобылянская, Москва сделан специально для журнала "Вестник вельш корги" 2016/1